品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | 貨號 | SKEM-0001 |
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規(guī)格 | 48T/96T | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 小鼠白細(xì)胞介素-1a含量測定 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
小鼠白細(xì)胞介素-1aELISA試劑盒
背景介紹:
IL-1有兩種不同的分子形式,一種IL-1α,由159個(gè)氨基酸組成;另一種稱為IL-1β,含153個(gè)氨基酸;兩者由不同的基因分別編碼。人和小鼠IL-1基因定位于2號染色體,均含7個(gè)外顯子。IL-1前體(ProIL-1)為31kDa,通過蛋白水解酶裂解形成成熟的IL-1分子。IL-1在不同種屬中有較高同源性。在氨基酸水平上,IL-1α和IL-1β在不同種屬同源性分別為60%~70%和75%~78%;但在同一種屬中IL-1α與IL-1β同源性只有25% 。IL-1α和IL-1β分子量約17.5kDa, 等電點(diǎn)分別為5和7,同源性為28%,IL-1α和IL-1β以同樣的親和力結(jié)合于相同的細(xì)胞表面受體,發(fā)揮相同的生物學(xué)作用。
檢測原理:
Solarbio (Solarbio ®)ELISA試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠IL-1a單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上;分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本,標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠IL-1a會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合;洗板后加入生物素化抗小鼠IL-1a抗體,該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠IL-1a發(fā)生特異性結(jié)合;洗板后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素,生物素與鏈霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合;洗板后加入顯色劑底物TMB,若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠IL-1a,則HRP會(huì)使無色TMB變成不同深淺(正相關(guān))的藍(lán)色物質(zhì),加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色;后,在λmax=450 nm(OD=450 nm)處測定反應(yīng)孔樣品吸光度(OD),樣本中的小鼠IL-1a濃度與OD成正比,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中小鼠IL-1a的濃度。
原理圖:
注意事項(xiàng):※※※
蓋上,使用前請離心處理(5-10 S即可),使管壁上的液體集中在管底部,取用時(shí),請用移液器小心吹打幾次。
劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。
安全提示:試劑盒中的終止液為酸性溶液,操作人員在使用時(shí)請帶上手套并注意防護(hù);在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛,如果不慎接觸,請用大量清水清洗;檢測血液樣本及其它體液樣本時(shí),請按國家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
試劑盒組成及儲(chǔ)存:
試劑盒組成 | 規(guī)格(96T) | 規(guī)格(48T) | 保存條件 |
抗體預(yù)包被酶標(biāo)板
| 8*12 | 8*6 | 2-8℃ |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 2支 | 1支 | -20 ℃ |
標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1) | 16 ml/瓶 | 8 ml/瓶 | 2-8℃ |
濃縮生物素化抗體 | 120 ul(100X) | 60 ul(100X) | 2-8℃ |
抗體稀釋液(SR2) | 16 ml/瓶 | 8 ml/瓶 | 2-8℃ |
濃縮酶結(jié)合物(避光) | 120 ul(100X) | 60 ul(100X) | 2-8℃ |
酶結(jié)合物稀釋液(SR3) | 16 ml/瓶 | 8 ml/瓶 | 2-8℃ |
濃縮洗滌液 (20×) | 30 ml/瓶 | 15 ml/瓶 | 2-8℃ |
顯色底物(避光) | 12 ml/瓶 | 6 ml/瓶 | 2-8℃ |
終止液 | 12 ml/瓶 | 6 ml/瓶 | 2-8℃ |
封板膠紙 | 4張 | 2張 |
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說明書 | 1份 | 1份 |
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自備實(shí)驗(yàn)器材(不提供,可代購)
樣本收集及儲(chǔ)存:
將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管,在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存(24小時(shí)內(nèi)檢測可放入2-8℃儲(chǔ)存),避免反復(fù)凍融。
室溫血液自然凝固20 min后,在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存(24小時(shí)內(nèi)檢測可放入2-8℃儲(chǔ)存),保存過程中如有沉淀,請?jiān)俅坞x心,避免反復(fù)凍融。
將全血收集到含抗血凝劑的管中,根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇EDTA,檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合20 min,在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存(24小時(shí)內(nèi)檢測可放入2-8℃儲(chǔ)存),避免反復(fù)凍融。
※注意:血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,以免影響檢測結(jié)果;如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的高值,請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測,建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。
試劑準(zhǔn)備:
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋:加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1)1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml),然后按照以下濃度:2000、1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml進(jìn)行稀釋。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液(2000pg/ml)未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,并將其貯存在-20~-80℃冰箱,具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液:預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量,用檢測稀釋液(SR2)將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋前充分混勻),請?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。
生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下:
板條 | 濃縮生物素化抗體(1:100):μL | 檢測稀釋液(SR2):μL |
2 | 20 | 1980 |
4 | 40 | 3960 |
6 | 60 | 5940 |
8 | 80 | 7920 |
10 | 100 | 9900 |
12 | 120 | 11880 |
5. 酶結(jié)合物工作液:按每次試驗(yàn)所需用量配制,用酶結(jié)合物稀釋液(SR3)將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋前離心),請?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。
酶結(jié)合物工作液具體稀釋方法如下:
板條 | 濃縮酶結(jié)合物(1:100):μL | 檢測稀釋液(SR3):μL |
2 | 20 | 1980 |
4 | 40 | 3960 |
6 | 60 | 5940 |
8 | 80 | 7920 |
10 | 100 | 9900 |
12 | 120 | 11880 |
6. 洗滌方法:
檢測步驟:
結(jié)果判斷:
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測,參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測,請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。
2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均OD值:每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),吸光度OD值為縱坐標(biāo),用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品中IL-1a含量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測,計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。
參數(shù)表征:
1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/ml) | OD值1 | OD值2 | 平均值 | 矯正值 |
0 | 0.055 | 0.059 | 0.057 | --- |
31.25 | 0.125 | 0.133 | 0.129 | 0.072 |
62.5 | 0.215 | 0.206 | 0.210 | 0.153 |
125 | 0.352 | 0.322 | 0.337 | 0.280 |
250 | 0.486 | 0.443 | 0.464 | 0.407 |
500 | 0.958 | 0.968 | 0.963 | 0.906 |
1000 | 1.636 | 1.652 | 1.644 | 1.587 |
2000 | 2.346 | 2.403 | 2.374 | 2.317 |
本圖僅供參考,應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠IL-1A的樣本含量
2. 靈敏度:
低可檢測小鼠IL-1a濃度達(dá)15pg/ml,
20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度OD的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,計(jì)算相應(yīng)的可檢測濃度。
3. 特異性:
不與小鼠IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、12、13反應(yīng),大鼠IL-1β等反應(yīng)
4. 重復(fù)性:
板內(nèi),板間變異系數(shù)<10%
5. 回收率:
在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的小鼠 IL-1a,計(jì)算回收率。
樣本類型 | 平均回收率(%) | 范圍(%) |
血漿 | 95 | 86-108 |
細(xì)胞培養(yǎng)上清 | 96 | 91-111 |
6. 線性稀釋:
分別在選取的4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 IL-1a,在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋,評估線性。
稀釋比例 | 回收率(%) | 血漿 | 細(xì)胞培養(yǎng)上清 |
1:2 | 平均回收率(% ) | 93 | 102 |
范圍(%) | 82-99 | 96-112 | |
1:4 | 平均回收率(% ) | 89 | 96 |
范圍(%) | 84-103 | 93-106 | |
1:8 | 平均回收率(% ) | 95 | 93 |
范圍(%) | 83-112 | 88-103 | |
1:16 | 平均回收率(% ) | 102 | 93 |
范圍(%) | 96-113 | 90-107 |
參考文獻(xiàn):
1. Greenfeder, S.A. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:13575.
2. Wesche, H. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:7727.
3. Sims, J.E. et al. (1994) Clin. Immunol. Immunopathol. 72:9.
4. Sims, J.E. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6155.
5. Colotta, F. and A. Mantovani (1994) Trends Pharmacol. Sci. 14:138.
6. Svenson, M. et al. (1993) Cytokine 5:427.
7. Giri, J.G. et al. (1994) J. Immunol. 153:5802.
常見問題及解決方法:
問題 | 可能原因 | 解決方法 |
高背景或陰性對照值偏高 | 洗板不充分 | 將洗滌液注入反應(yīng)孔充分洗滌,*拍干孔中液體 |
酶結(jié)合物過量 | 檢查酶稀釋度,按說明書標(biāo)識的稀釋度稀釋 | |
底物污染 | 加底物前檢查底物是否為透明無色,請勿用變藍(lán)的底物,重新用新的底物試驗(yàn) | |
陰性對照孔被陽性對照污染 | 注意洗滌時(shí)不要把洗液溢出孔外,不使陰陽對照孔液體漣接一起 | |
不同批次試劑混用 | 檢查試劑批號,請勿用不同批次試劑 | |
顯色信號弱 | 試劑過期 | 檢查試劑盒有效期,請勿用過期試劑 |
孵育時(shí)間過短 | 按說明書中規(guī)定的時(shí)間孵育 | |
試劑污染 | 檢查試劑是否污染,請勿用污染的試劑 | |
酶標(biāo)儀濾光片不匹配 | 檢查酶標(biāo)儀設(shè)置及濾光片是否匹配 | |
試劑盒平衡不充分 | 確保試劑盒試驗(yàn)前平衡室溫 | |
顯色時(shí)間不夠 | 增加底物顯色時(shí)間 | |
無顯色信號 | 檢測抗體、酶、或顯色劑漏加 | 檢查試驗(yàn)操作流程,重復(fù)試驗(yàn) |
酶被疊氮鈉污染 | 請使用重新配制的試劑 | |
試劑添加順序有誤 | 檢查復(fù)核試驗(yàn)添加順序、流程,重復(fù)試驗(yàn) | |
標(biāo)曲佳但樣品孔無信號 | 樣品中靶標(biāo)物含量低或樣品中無靶標(biāo)物 | 設(shè)置陽性對照,重復(fù)實(shí)驗(yàn) |
樣品基質(zhì)效應(yīng)影響檢測 | 重新稀釋樣品后復(fù)測 | |
標(biāo)曲佳但樣品信號偏高 | 樣品中待檢物含量超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍 | 重新稀釋樣品后復(fù)測 |
邊緣效應(yīng) | 孵育溫度不均衡 | 孵育時(shí)每步均使用新的封板膠紙,避免在環(huán)境溫度變化大的地方孵育,勿疊放反應(yīng)板 |
小鼠白細(xì)胞介素-1aELISA試劑盒訂購說明:
1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨,一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。
2、部分非常用產(chǎn)品,需提前1-2日預(yù)訂,海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。
3、部分產(chǎn)品價(jià)格會(huì)因貨期、批次等因素發(fā)生變化,若有變動(dòng)以訂貨當(dāng)日新價(jià)格為準(zhǔn)。
4、每日訂單截止時(shí)間為16點(diǎn)整,部分城市可到17點(diǎn)整,因超過截止時(shí)間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5、請辦理完貨款后,將底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。
運(yùn)輸說明:
極低溫產(chǎn)品:極低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中加裝干冰運(yùn)輸。用干冰把產(chǎn)品包裹起來,再用泡沫盒密封,膠帶層層粘住泡沫盒,放入索萊寶的箱子,然后交付給合作快遞,安全快速高效放心的送客戶的手中,保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一,為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
低溫產(chǎn)品:低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中加裝索萊寶冰袋運(yùn)輸。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來,再使用泡沫盒密封,用膠帶嚴(yán)實(shí)密封泡沫盒,再放入索萊寶的箱子(保溫效果少可以持續(xù)一周),然后交付給合作快遞,安全快速高效放心的送客戶的手中,保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一,為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
常溫產(chǎn)品:常溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中無需加冰或者特殊包裝。產(chǎn)品由公司庫房人員快速配貨,準(zhǔn)確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達(dá)您的手中。