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  • TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
產(chǎn)品名稱:

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品品牌: 價格:
廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-07-31
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
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Ex/Em (nm)556/579MWN/ACAS #N/ASolventN/AStorageF/D/LCategoryCell Analysis
Cell Cytotoxicity

產(chǎn)品概述

貨號T2190規(guī)格50T
供貨周期現(xiàn)貨主要用途Printer Friendly Version
應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),石油

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端,從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測,這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH形成,很少能夠被染色。由此,TUNEL成為了檢測DNA段化(細(xì)胞凋亡)的常用方法。(以下是TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光))
二、TUNEL實驗中關(guān)鍵步驟
1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先 60ºC 20 min,再用使用二甲苯兩次 5-10 min;而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻;
2.把握好細(xì)胞通透的時間。一般根據(jù)切片的厚薄,選擇蛋白酶k的孵育時間,常用 10-30 min,幾 μm 切片用短時間;幾十 μm 切片用長時間,通過摸索達(dá)到既不脫片,有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。
3.適當(dāng)延長 TUNEL 反應(yīng)液的時間。一般是37ºC 1 h,你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度,選擇更長的時間,可長 2 h,但要結(jié)合你終的背景著色。
4.DAB 顯色條件的選擇。一般 DAB 反應(yīng)10 min 左右,結(jié)合鏡下控制背景顏色,長不超過 30 min;promega 公司提供的 DAB 液(桃紅色),不利于辨認(rèn)棕褐色,我不太喜歡。
5.PBS 的充分清洗。我個人認(rèn)為,在 TUNEL 反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格,可增加次數(shù)達(dá) 5 次,因為這些清洗直接決定后切片的非特異性著色。
6. 此外,內(nèi)源性 POD 的封閉也十分關(guān)鍵。對于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織,我的經(jīng)驗是適當(dāng)延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度,可以達(dá)到很好的封閉效果,且不影響終的特異性染色。
三、細(xì)胞通透的時間選擇
1.蛋白酶 k 的目的是通透細(xì)胞膜和核膜,從而使反應(yīng)試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng),提高陽性率。但濃度過高或孵育時間太長容易脫片,只要不脫片,好像影響不大,其作用類似與 TritonX100 等細(xì)胞通透劑。
2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml,可用 PBS 配制,也可用蛋白酶K緩沖液(100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA);然后分裝成小份,用完一支再用下一支,-20ºC保存 1 個月應(yīng)該沒問題的(重復(fù)拿的那支),而一直冷凍的少可以用半年以上。
3. 蛋白酶K反應(yīng)時間一般為10-30 min,具體時間長短與切片厚薄有關(guān),4 μm左右的片子可以用 10 min,但30 μm左右的可用30 min,終通過摸索時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。
關(guān)鍵試劑操作條件
DAB 顯色反應(yīng)大約需要10 min,要控制好反應(yīng)時間,勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來源和切片厚度、試劑盒種類不同來摸索一下。
蛋白酶K工作液處理時間、溫度須在范圍內(nèi)摸索,溫度過高,時間過長,易破壞核酸結(jié)構(gòu),出現(xiàn)假陽性。
DNase 1 一般室溫,10 min 即可。
四、如何減弱非特異性染色
若是肝臟或腎臟,因富含內(nèi)源性過氧化物酶,需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間。其他還可以加強(qiáng)滅活、縮短 DAB 孵育時間、PBS 充分清洗,注意鏡下把握好著色。
Tips
1.濕盒用帶蓋方盤,里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片,使用時稍加水即可。
2.英文說明書中對組織細(xì)胞通透這一步中,加了“對難處理的組織的處理”,意思是用常規(guī)方法處理(如蛋白酶 K)后,應(yīng)該陽性而做不出陽性時,可用微波修復(fù)。
3.復(fù)染的目的是為了襯托組織形態(tài)結(jié)構(gòu),以利于結(jié)果分析,石蠟切片常用蘇木素,核染成蘭色,冷凍切片常用甲基綠,核染成綠色。
4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制,現(xiàn)在有賣的,自己加蒸餾水稀釋后即可用,很方便,也不貴。
5.蛋白酶 K 消化蛋白后,需要用封閉液。

參考文獻(xiàn):
《The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell》 作者:Ruifeng Zhao , Jing Jin , Xinyu Sun , Kai Jin , Man Wang , Mahmoud F. Ahmed , Qisheng Zuo , Yani Zhang ,Zhenhua Zhao , Guohong Chen , Bichun Li 期刊:Journal of cellular Biochemistry 影響因子:3.062 PMID:30076744
《Crizotinib induces apoptosis of lung cancer cells through JAK-STAT pathway》 作者:Hongmin Lu Shibo Wu Huafei Chen Ying Huang Guoqin Qiu g Liu Yong Li 期刊:Oncology Letters 影響因子:1.871 PMID:30333870
《Knockdown of TLR4 attenuates high glucose-induced podocyte injury via the NALP3/ASC/Caspase-1 signaling pathway》 作者:Yang Liu,Zhonggao Xu,Fuzhe Ma,Ye Jia,Guannan Wang 期刊:Biomedicine & Pharmacotherapy 影響因子:3.743 PMID:30257355


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TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

 

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