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| 品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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| 分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
| 分子量 | 詳詢 | 貨號(hào) | BC2410 |
| 規(guī)格 | 50T/48S | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
| 主要用途 | 磷脂酶D(PLD)檢測(cè) | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合 |
磷脂酶D（PLD）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
可見分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào)：BC2410
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6mL×1支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體70 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體45 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1．提取液二：試劑易揮發(fā)，用完后快速擰蓋，封口膜纏口；
2．試劑三：試劑放于試劑瓶?jī)?nèi)玻璃管中。臨用前取一支加入3mL乙醇充分溶解后取上清使用；2-8℃可以分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；
3．標(biāo)準(zhǔn)品：50umol/mL 膽*溶液，臨用前用試劑一稀釋100倍即500nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用（可以取10μL 50umol/mL 膽*溶液加入990μL試劑一混勻即500nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液 ）。
產(chǎn)品說(shuō)明：
磷脂酶D（Phospholipases D，PLD）催化水解磷脂酰膽*末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽*，膽*在膽*氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下將4-氨基安*比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、超速冷凍離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、天平、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水、無(wú)水乙醇和冰。
操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例加入提取液，建議稱取約0.1g樣本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴勻漿后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
2、 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
3、 血清（漿）：直接測(cè)定。
二、測(cè)定步驟
1、 可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到500nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定：
試劑名稱 (μL) | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 |
試劑一 | 100 | - | - |
試劑二 | 150 | 150 | 150 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | - | 100 | - |
樣 品 | - | - | 100 |
試劑三 | 100 | 100 | 100 |
充分混勻，30℃反應(yīng)30min，沸水浴10min，打開蓋子，自然冷卻5min。 | |||
試劑四 | 700 | 700 | 700 |
30℃反應(yīng)30min，測(cè)定500nm處吸光值，分別記為A空白管、A標(biāo)準(zhǔn)管和A測(cè)定管。計(jì)算ΔA標(biāo)準(zhǔn)= | |||
三、酶活計(jì)算
1、 按蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽*產(chǎn)生1nmol膽*所需的酶量一個(gè)酶活力單位。
PLD活性 (U/mg prot) =ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V提取÷(Cpr×V提取)÷T = 16.7×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr
2、 按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽*產(chǎn)生1nmol膽*所需的酶量一個(gè)酶活力單位
PLD活性 (U/g 質(zhì)量) = ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V提取÷W÷T = 16.7×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W
3、 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽*產(chǎn)生1nmol膽*所需的酶量一個(gè)酶活力單位。
PLD活性(U/104 cell）= ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V提取÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量
4、 按血清（漿）計(jì)算：
酶活定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽*產(chǎn)生1nmol膽*所需的酶量一個(gè)酶活力單位。
PLD活性（U/mL）= ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V血清（漿）÷V血清（漿）÷T = 16.7×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)
C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，500nmol/mL；V提取：加入的提取液體積（提取液一+提取液二），1mL；V血清(漿)：血清(漿)體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；細(xì)胞數(shù)量：以萬(wàn)計(jì)；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。
注意事項(xiàng)：
1. 顯色完成后，若有沉淀，于8000g，25℃離心5min后取上清測(cè)定。
2. 吸光值不宜超過(guò)1，否則用試劑一將酶液進(jìn)行稀釋，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC2420/BC2425 磷脂酶C（PLC）活性檢測(cè)試劑盒
BC2430/BC2435 磷脂酶A2（PLA2）活性檢測(cè)試劑盒
磷脂酶D(PLD)檢測(cè)試劑盒 脂肪酸代謝 磷脂酶D(PLD)檢測(cè)試劑盒 脂肪酸代謝
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