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| 品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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| 分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
| 分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC5320 |
| 規(guī)格 | 50T/48S | 供貨周期 | 現貨 |
| 主要用途 | 高密度脂蛋白膽*醇含量檢測 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農林牧漁,綜合 |
高密度脂蛋白膽*醇（HDL-C）含量檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC5320
規(guī)格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 自備試劑 | - |
提取液二A | 液體7.5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二B | 液體7.5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體70 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體0.45 mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體0.07 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 提取液一：自備異丙醇，大約需要60mL，常溫保存；試劑盒內提供一個30mL棕色空瓶，僅做分裝使用，請自行標注試劑名稱。
2. 提取液二：臨用前根據樣本量將提取液二A：提取液二B=100μL：100μL（約1T）的比例配制提取液二，當天用完。
3. 試劑四：液體置于試劑瓶內EP管中。
4. 標準品：10 mg膽*醇，臨用前加入517 μL提取液一，振蕩溶解，即為50 μmol/mL的膽*醇標準溶液。
5. 工作液的配制：根據樣本量按試劑一：試劑二：試劑三：試劑四=0.63mL：8.37mL：60 μL：9 μL（共9.069mL，約10T）的比例配制工作液，現用現配。
產品說明：
高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）是血清脂蛋白中密度最大、顆粒最小的脂蛋白，主要作用為將周圍組織的膽*醇運送到肝臟進行降解。眾多流行病學研究表明，HDL-C水平與動脈粥樣硬化（AS）、冠心?。?/span>GHD）呈負相關，對于臨床診斷動脈粥硬化、冠心病、高血壓等疾病有重要參考價值。
使用選擇性沉淀劑將HDL-C特異性分離出來，利用酯酶催化膽*醇酯水解生成游離膽*醇（FC）和游離脂肪酸（FFA），從而把膽*醇酯轉化為FC；進一步利用膽*醇氧化酶催化FC氧化，生成4-膽甾烯酮和H2O2；最后利用過氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替*林和苯胺類似物，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰，其顏色深淺與HDL-C含量成正比。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、天平、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、可調式移液槍、冰、蒸餾水、異丙醇。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一）進行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
2. 細菌/細胞：按照細胞數量（104個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300W，超聲2秒，間隔3秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清（漿）等液體樣本：直接測定。若有沉淀請離心后取上清待測。
二、測定步驟
1. 可見分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至546nm，蒸餾水調零。
2. 標準溶液的稀釋：將50μmol/mL膽*醇標準溶液用提取液一進行稀釋得到 2、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125μmol/mL的標準溶液備用。
3. 標準溶液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準溶液體積（µL） | 提取液一體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） |
1 | 50 | 40 | 960 | 2 |
2 | 2 | 625 | 375 | 1.25 |
3 | 1.25 | 500 | 500 | 0.625 |
4 | 0.625 | 500 | 500 | 0.3125 |
5 | 0.3125 | 500 | 500 | 0.15625 |
6 | 0.15625 | 500 | 500 | 0.078125 |
備注：實驗中每個標準管需200µL標準溶液。
4. 在1.5mLEP管按下表步驟加樣：
試劑名稱（µL） | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 200 | - | - |
標準溶液 | - | 200 | - |
提取液二 | 200 | 200 | - |
充分混勻，常溫靜置10min，3000rpm常溫離心15min，取上清。 | |||
上清 | 100 | 100 | - |
提取液一 | - | - | 100 |
工作液 | 900 | 900 | 900 |
充分混勻，37℃靜置1h，反應完成后測定546nm處吸光值A，分別記為A測定、A標準和A空白，ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標準=A標準-A空白。空白管和標準曲線只需測1-2次。
注：若樣本為血清（漿）等液體樣本，則需要增加‘血清（漿）空白管’-即將空白管中的提取液一（異丙醇）更換為蒸餾水進行實驗，計算ΔA測定=A測定-A血清（漿）空白，標準管測定及ΔA標準計算不變。
三、高密度脂蛋白膽*醇含量計算
1. 標準曲線的繪制：
根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。
2. HDL-C含量的計算：
（1）按血清（漿）等液體體積計算：
HDL-C含量（μmol/dL）=x×100
（2）按樣本蛋白濃度計算：
HDL-C含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）=x÷Cpr
（3）按樣本質量計算：
HDL-C含量（μmol/g 質量）=x×V提取÷W=x÷W
（4）按細胞/細菌數量計算：
HDL-C含量(μmol/104 cell)=x×V提取÷N=x÷N
100：單位換算系數，1dL=100mL；V提取：加入提取液一的體積，1mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞總數，以萬計。
注意事項：
1. 如果測定吸光值低于或者超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用提取液一稀釋樣本（液體樣本用蒸餾水稀釋）后再進行測定。注意同步修改計算公式。
2. 提取液一中含有使蛋白變形的成分，故按蛋白濃度計算時需要重新提取蛋白進行測定。
實驗實例：
1、 取0.2mL人血清樣本，按照測定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.216-0.027=0.189，根據標準曲線y=0.7591x-0.0528，計算x=0.319，按血清（漿）等液體體積計算：
HDL-L含量（μmol/dL）=x×100=0.319×100=31.854 μmol/dL。
2、 取0.1g鼠肝樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿，離心后取上清按照測定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.082-0.027=0.055，根據標準曲線y=0.7591x-0.0528，計算x=0.142，按樣本質量計算：
HDL-L含量（μmol/g 質量）=x÷W=0.142÷0.1=1.420 μmol/g 質量。
參考文獻：
[1] Warnick G R, Nauck M, Rifai N I. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays[J]. Clinical Chemistry, 2001, 47(9):1579-1596.
[2] Yan S, Lin Q. Methods for Detection of High-Density Lipoprotein Cholesterol and its Standardization[J]. Chinese Journal of Laboratory Medicine, 1998, 21(1): 19-22.
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